La técnica de electroforesis y su uso en el estudio de proteínas vegetales
La electroforesis como su nombre lo indica es una técnica que se utiliza para la separación de moléculas en base a su carga eléctrica, mediante su movilización en un campo donde se ha establecido una diferencia de potencial eléctrico. Las moléculas se mueven desde un polo negativo (cátodo) hacia un polo positivo (ánodo) dependiendo de su carga eléctrica.
Dentro de las moléculas orgánicas los ácidos nucleicos, los aminoácidos y las proteínas pueden ser separadas mediante electroforesis.
Establecimiento del campo electrico
Para establecer un diferencial de cargas eléctricas se utiliza una solución buffer a un pH determinado, el cual es colocado en una cámara de electroforesis que tiene dos electrodos conectados a una fuente de poder, con la cual se aplica un voltaje preestablecido dependiendo del análisis a realizar. Las cámaras de electroforesis pueden ser verticales u horizontales
)FuenteSoporte por donde se movilizan las proteínas
Los más utilizados son los geles de poliacrilamida y de agarosa. También usan geles de almidón pero estos tienen la desventajas que son opacos y no se ven claramente las bandas, su ventaja es que es economico y no es tóxico.
El gel de poliacrilamida se forma por la reacción de la acrilamida y la bisacrilamida, los cuales forman un matriz cuyo tamaño de los poros va a depender de la concentración de acrilamida. A mayor concentración de acrilamida menor tamaño de los poros. Esto representa una ventaja, cuando se separan las proteínas en base su peso o tamaño molecular.
La proporción entre acrilamida y bis acrilamida debe mantenerse en 95 a 5, es decir que por cada 95 g de acrilamida se debe agregar 5 gramos de bisacrilamida. Esto garantiza que el gel tenga una consistencia fácil de manejar y los poros sean estables.
Este gel tiene como ventajas que es muy claro y permite visualizar las bandas de proteína y se pueden separar las moléculas no solo en base a su carga eléctrica sino también en base a su tamaño.
La desventaja más importante que hay que tener en cuenta es la toxicidad de sus componentes. La acrilamida y la bis-acrilamida son neurotóxicos, tienen que ser manipulados con guantes y evitar derramarlos en los mesones. Una vez gelificado, no representa ningún problema y se puede manipular sin riesgo.
Reacción de polimerización:
La acrilamida y bisacrilamida polimerizan cuando se agrega persulfato de amonio,un agente iniciador de la reacción y el TEMED (N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina)) el cual cataliza la reacción, este se prepara en un solución buffer , generalmente se utiliza el Tris-HCl
Preparación de la muestra para la corrida electroforética
Por corrida electroforética se entiende la movilización de los componentes de la muestra en el campo eléctrico.Las proteínas pueden extraidas de cualquier tejido vegetal, mediante un procedimiento que varía dependiendo del tejido. Al extracto de proteínas se le agrega una solución buffer (el buffer trisglicina es uno de los más utilizados), sacarosa o glicerol para aumentar su densidad y un colorante de corrida, para observar por donde se está movilizando las proteinas, generalmente se utiliza el azul de bromofenol, es una molécula muy pequeña que va adelante en el frente de corrida e indica cuando se debe detener, para no perder las proteínas, que se movilizan más rápido.
Sistemas utilizados para la separación electroforética
- Sistema continuo: en este tipo de separación se utiliza una concentración de acrilamida en todo el gel, en este caso las proteínas se separaran por su carga eléctrica, sin considerar su tamaño.
- Sistema discontinuo: en este tipo de separación se utilizan dos o tres concentraciones de acrilamida en el gel, de esta manera se separan las proteínas por su carga eléctrica y por su peso o tamaño molecular. El gel va a tener dos o tres tamaños de poro, por donde las proteínas pasaran o serán retenidas. En este sistema también se varia el pH de cada gel. El gel acumulador con pH 6.8 y el gel separador con pH 8.8. Este sistema permite la obtención de bandas más nítidas .
Condiciones de corrida
Se establece el voltaje durante la corrida dependiendo del sistema que se va a utilizar. Se debe llevar un registro del tiempo de corrida y las variaciones en el amperaje.
Tinción de los geles e identificación de las proteínas
Una vez finalizada la corrida, el gel se separa de la cámara de electroforesis y se coloca en las bandejas de tinción, donde se agregan las soluciones que permiten visualizar las proteínas. Se utiliza el azul de Coomasie como colorante.
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Una medida que se utiliza para calcular la movilidad de cada banda o proteína es el valor de movilidad relativa o Rf
Esta técnica también permite la separación de enzimas, mediante la tinción en soluciones específicas con los componentes de la reacciones quimicas que catalizan y una reacción de coloración que permite visualizalas en el gel.
Por ejemplo para identificar las peroxidasas se utilizan los siguientes reactivos
Dianisidina como colorante
Metanol
Fosfato de sodio
Peroxido de hidrógeno
La reacción es inmediata y aparecen las bandas de color naranja. Cada banda corresponde a una isoenzima, es decir una peroxidasa que tiene una conformación estructural diferente, pero que cataliza la misma reacción química.
En esta figura se observan las isoenzimas de hojas de caña de azúcar, cada muestra es una variedad diferente. Se puede observar que los patrones son muy similares, con la excepción de una banda en la muestra número 5, que no está presente en las otras muestras.
Electroforesis de punto isoelectrico o electroenfoque
Esta separación se realiza en base al punto isoelectrico de las proteínas. El punto isoelectrico es el pH en el cual las cargas positivas y negativas se anulan y la carga de la proteína es cero. Para separar las proteinas se establece un gradiente de pH y cada proteína se detiene en su punto isoelectrico.
Electroforesis Bidimensional
Esta técnica consiste en hacer una doble corrida electroforetica, esto se hace con la finalidad de separar las proteínas que debido a su carga electrica y tamaño similar no pueden ser separadas con una sola corrida. Generalmente se hace una primera corrida en base a su punto isoelectrico y luego se corta el gel donde está ubicada la banda y se coloca en otro gel, para separarse en una segunda corrida en un gel discontinuo. Una vez teñido el gel, se observa un conjunto de puntos o manchas que correspondena las diferentes proteínas de la muestra.
En esta imagen se observan las proteínas de la hoja del cultivo de arroz separadas por electroforesis bidimensional. Cada mancha correponde a una proteína diferente, las más oscuras son aquellas que están en mayor concentración. Las proteinas pueden ser analizadas e identificadas con la técnica de Espectrometria de masas.
Usos de la técnica
- Estudiar la variabilidad o la diversidad genética en especies cultivadas o silvestre.
- Estudiar proteínas o enzimas asociadas a características especificas de las plantas bajo condiciones de estrés biótico (enfermedades y plagas) y abiótico (temperaturas, sequia, salinidad, exceso de humedad)
- Caracterizar las proteínas en base a su carga y peso molecular .
Referencias bibliograficas
- https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/16%20ELECTROFORESIS%20GELES%20PAA.pdf
- Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. Descripción del método
SDS-PAGE - http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm
- http://www3.uah.es/chemevol/index.php/sds-page-electroforesis-en-gel-de-poliacrilamida/
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